作为血管内皮生长因子受体的f1k-1
2019-12-11

作为血管内皮生长因子受体的f1k-1

本发明涉及使用Flk-1受体的配体以调节血管形成和维管形成。本发明部分是以基于Flk-1酪氨酸激酶受体表达与内皮细胞相关的证实并及血管内皮生长因子(VEGF)作为Flk-1的高亲和性配体的鉴定为基础的。这些结果指明了在维管形成和血管形成期间在信号系统中Flk-1的主要作用。公开了因表达Flk-1的宿主细胞的基因工程设计以及被表达的Flk-1对评价和筛选与通过激动剂或是拮抗剂活性的Flk-1调节相关的VEGF药物和类似物的用途。本发明也涉及Flk-1配体,包括VEGF激动剂和拮抗剂,在通过调节维管形成和血管形成治疗疾病,包括癌症上的用途。

企图抑制Flk-1/VEGF相互作用的药剂可用于抑制肿瘤生长。VEGF和/或VEGF激动剂可用以促进伤口愈合。本发明涉及预定为生产表达Flk-1受体的Flk-1蛋白和/或细胞系的表达体系。可溶的重组体Flk-1蛋白的表达可用于筛选抑制Flk-1/VEGF相互作用的分子的肽库。在它们表面上表达Flk-1的工程细胞系可有利地用以选筛和鉴别VEGF激动剂和拮抗剂。

图8.在早期胚胎和胚外组织中的Flk-1表达的原位杂交分析。(A)在用Flk-1探针的母体脱落物中的8.5天小鼠胚胎的矢形区。箭头指出了强烈表达Flk-RNA的母体血管的内皮。(C)9.5天小鼠胚胎卵黄囊和滋养外胚层的高倍放大。(D)血岛的高倍放大。缩写:A,尿囊;Bi,血岛;Bv,母体血管;D,脱落物;En,卵黄囊的内皮层;M,间质;Ms,卵黄囊的中胚层;NF,神经褶;T,滋养层;Y,卵黄囊。

GGA AGT GGT CCT GTC CCG CCT CCG CCC CCA ACT CCT GGA AAT CAC GAG      4374Gly Ser Gly Pro Val Pro Ala Pro Pro Pro Thr Pro Gly Asn His Glu1350                1355                1360AGA GGT GCT GCT TACATTTTCA AGTGTTGTTC TTTCCACCAC CCGGAAGTAG          4426Arg Gly Ala Ala1365CCACATTTGA TTTTCATTTT TGGAGGAGGG ACCTCAGACT GCAAGGAGCT TGTCCTCAGG    4486GCATTTCCAG AGAAGATGCC CATGACCCAA GAATGTGTTG ACTCTACTCT CTTTTCCATT    4546CATTTAAAAG TCCTATATAA TGTGCCCTGC TGTGGTCTCA CTACCAGTTA AAGCAAAAGA    4606CTTTCAAACA CGTGGACTCT GTCCTCCAAG AACTGGCAAC GGCACCTCTG TGAAACTGGA    4666TCGAATGGGC AATGCTTTGT GTGTTGAGGA TGGGTGAGAT GTCCCAGGGC CGAGTCTGTC    4726TACCTTGGAG GCTTTGTGGA GGATGCGGGC TATGAGCCAA GTGTTAAGTG TGGGATGTGG    4786ACTGGGAGGA AGGAAGCCGC AAGTCGCTCC GAGAGCGGTT GGAGCCTGCA GATGCATTGT    4846GCTGGCTCTG GTGGAGGTGG GCTTGTGGCC TGTCAGGAAA CGCAAAGGGG GCCGGCAGGG    4906TTTGCTTTTG GAAGGTTTCC GTGCTCTTCA CAGTCGGGTT ACAGGCGAGT TCCCTGTGGC    4966GTTTCCTACT CCTAATGAGA GTTCCTTCCG GACTCTTACG TGTCTCCTGG CCTGGCCCCA    5026GGAAGGAAAT GATGCAGCTT GCTCCTTCCT CATCTCTCAG GCTGTGCCTT AATTCAGAAC    5086ACCAAAAGAG AGGAACGTCG GCAGAGGCTC CTGACGGGGC CGAAGAATTG TGAGAACAGA    5146ACAGAAACTC AGGCTTTCTG CTGGGTGGAG ACCCACGTGG CGCCCTGGTG GCAGGTCTGA    5206GGGTTCTCTG TCAAGTGGCG GTAAAGGCTC AGGCTGGTGT TCTTCCTCTA TCTCCACTCC    5266TGTCAGGCCC CCAAGTCCTC AGTATTTTAG CTTTGTGGCT TCCTGATGGC AGAAAAATCT    5326TAATTGGTTG GTTTGCTCTC CAGATAATCA CTAGCCAGAT TTCGAAATTA CTTTTTAGCC    5386GAGGTTATGA TAACATCTAC TGTATCCTTT AGAATTTTAA CCTATAAAAC TATGTCTACT    5446GGTTTCTGCC TGTGTGCTTA TGTT                                           5470(2) INEORMATION FOR SEQ ID NO:2:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:(A)LENGTH:1367 amino acid:(B)TYPS:amino acid(D)TOPOLOGY:linear(ii)MOLECULE TYPE:protain(xi)SEQUENCE DESCRIPTION:SEQ ID NO:2:Met Glu Ser Lys Ala Leu Leu Ala Val Ala Leu Trp Phe Cys Val Glu1               5                  10                  15Thr Arg Ala Ala Ser Val Gly Leu Thr Gly Asp Phe Leu His Pro Pro20                  25                  30Lys Leu Ser Thr Gln Lys Asp Ile Leu Thr Ile Leu Ala Asn Thr Thr35                  40                  45Leu Gln Ile Thr Cys Arg Gly Gln Arg Asp Leu Asp Trp Leu Trp Pro50                  55                  60

作为血管内皮生长因子受体的Flk-1

这些体系的表达要素的强度和特异性可变。根据所用的宿主/载体体系,在表达载体中可使用任何数量的合适的转录和转译成分,这包括构成性的和可诱导的启动子。例如,当在细菌体系中克隆时,可使用可诱导的启动子,如噬菌体λ、plac、ptrp、ptac、(ptrp-lac杂种启动子)等的PL;当在昆虫细胞体系中克隆时,可使用诸如杆状病毒、多面体启动子等启动子;当在植物细胞体系中克隆时可使用由植物细胞基因组得到的启动子(例如,热休克启动子;RUBISCO小亚单位启动子;叶绿素a/b结合蛋白启动子)或由植物病毒得到的启动子(例如,CaMV的35S RNA启动子;TMV外壳蛋白启动子);当在哺乳动物细胞得到的启动子(例如,金属硫因启动子)或由哺乳动物病毒得到的启动子(例如,腺病毒晚期启动子;牛豆病毒7.5K启动子);当产生含有多次复制的Flk-1 DNA的细胞系时,可使用具有合适的可选择标志的SV40-、BPV-和EBV-基的载体。

图7.在肾小球中表达Flk-1。(A)与Flk-1反义探针杂交的出生后四天肾的平行矢形区。如箭头所指出,杂交信号积累在肾小球中。(E)与有意义探针相邻区域的对比杂交(C)用Flk-1探测过的成年肾的矢形区。箭头指出了肾小球。(D)高倍放大的成年肾小球。(A)和(D)中的箭头指出了排列在表达Flk-1的近小球区域的链中的细胞。

(2)抗体产生和筛选现有技术中已知的各种方法都可用于产生抗经重组产生的Flk-1受体的抗原决定基的抗体。这些抗体包括,但不限于多克隆、单克隆、嵌合、单链、Fab片段和由一个Fab表达库产生的片段。例如,争夺受体VEGF结合位点的那些中和抗体对诊断和治疗特为优选。

ATG GAT CCA GAT GAA TTG CCC TTG GAT GAG CGC TGT GAA CGC TTG CCT      2742Met Asp Pro Asp Glu Leu Pro Leu Asp Glu Arg Cys Glu Arg Leu Pro805                 810                 815TAT GAT GCC AGC AAG TGG GAA TTC CCC AGG GAC CGG CTG AAA CTA GGA      2790Tyr Asp Ala Ser Lys Trp Glu Phe Pro Arg Asp Arg Leu Lys Leu Gly820                 825                 830                 835AAA CCT CTT GGC CGC GGT CCC TTC GGC CAA GTG ATT GAG GCA GAC GCT      2836Lys Pro Leu Gly Arg Gly Ala Phe Gly Gln Val Ile Glu Ala Asp Ala840                 845                 850TTT GGA ATT GAC AAG ACA GCG ACT TGC AAA ACA GTA GCC GTC AAG ATG      2886Phe Gly Ile Asp Lys Thr Ala Thr Cys Lys Thr Val Ala Val Lys Met855                 860                 865TTG AAA GAA GGA GCA ACA CAC AGC GAG CAT CGA GCC CTC ATG TCT GAA      2934Leu Lys Glu Gly Ala Thr His Ser Glu His Arg Ala Leu Met Ser Glu870                 875                 880CTC AAG ATC CTC ATC CAC ATT GGT CAC CAT CTC AAT GTG GTG AAC CTC      2982Leu Lys Ile Leu Ile His Ile Gly His His Leu Asn Val Val Asn Leu885                 890                 895CTA GGC GCC TGC ACC AAG CCG GGA GGG CCT CTC ATG GTG ATT GTG GAA      3030Leu Gly Ala Cys Thr Lys Pro Gly Gly Pro Leu Met Val Ile Val Glu900                 905                 910                 915TTC TGC AAG TTT GGA AAC CTA TCA ACT TAC TTA CGG GGC AAG AGA AAT      3078Phe Cys Lys Phe Gly Asn Leu Ser Thr Tyr Leu Arg Gly Lys Arg Asn920                 925                 930GAA TTT GTT CCC TAT AAG AGC AAA GGG GCA CGC TTC CGC CAG GGC AAG      3126Glu Phe Val Pro Tyr Lys Ser Lys Gly Ala Arg Phe Arg Gln Gly Lys935                 940                 945GAC TAC GTT GGG GAG CTC TCC GTG GAT CTG AAA AGA CGC TTG GAC AGC      3174Asp Tyr Val Gly Glu Leu Ser Val Asp Leu Lys Arg Arg Leu Asp Ser950                 955                 960ATC ACC AGC AGC CAG AGC TCT GCC AGC TCA GGC TTT GTT GAG GAG AAA      3222Ile Thr Ser Ser Gln Ser Ser Ala Ser Ser Gly Phe Val Glu Glu Lys965                 970                 975TCG CTC AGT GAT GTA GAG GAA GAA GAA GCT TCT GAA GAA CTG TAC AAG      3270Ser Leu Ser Asp Val Glu Glu Glu Glu Ala Ser Glu Glu Leu Tyr Lys980                 985                 990                 995GAC TTC CTG ACC TTG GAG CAT CTC ATC TGT TAC AGC TTC CAA GTG GCT      3318Asp Phe Leu Thr Leu Glu His Leu Ile Cys Tyr Ser Phe Gln Val Ala1000                1005                1010AAG GGC ATG GAG TTC TTG GCA TCA AGG AAG TGT ATC CAC AGG GAC CTG      3366Lys Gly Met Glu Phe Leu Ala Ser Arg Lys Cys Ile His Arg Asp Leu1015                1020                1025GCA GCA CGA AAC ATT CTC CTA TCG GAG AAG AAT GTG GTT AAG ATC TGT      3414Ala Ala Arg Asn Ile Leu Leu Ser Glu Lys Asn Val Val Lys Ile Cys1030                1035                1040GAC TTC CGC TTG GCC CGG GAC ATT TAT AAA GAC CCG GAT TAT GTC AGA      3462Asp Phe Gly Leu Ala Arg Asp Ile Tyr Lys Asp Pro Asp Tyr Val Arg1045                1050                1055AAA GGA GAT GCC CGA CTC CCT TTG AAG TGG ATG GCC CCG GAA ACC ATT      3510Lys Gly Asp Ala Arg Leu Pro Leu Lys Trp Met Ala Pro Glu Thr Ile1060                1065                1070                1075

在本发明的一个实施方案中,可通过在被选择的细胞中表达来鉴别具有显性阴性效果的突变体形式的Flk-1分子。保持形成具有野生型Flk-1蛋白,但不能在信号转导中起作用的二聚物的能力的Flk-1缺失或错义突变体可用于抑制内源野生型Flk-1的生物活性。例如,Flk-1的细胞激酶区可缺失,结果形成仍能经受与内源野生型受体的二聚化作用,但不能转换信号的平截Flk-1分子。

在使用植物表达载体的场合下,Flk-1编码序列的表达可由任何的启动子引发。例如,可使用病毒启动子,如CaMV的35SRNA和19SRNA启动子(Brisson et al.,1984,Nature310:511-514),或TMV的外壳蛋白启动子(Takamatsu et al.,1987,EMBO J.6:307-311);另一方面,可以使用植物启动子,如RUBISCO的小亚单位(Coruzzi et al.,1984,EMBO J.3:1671-1680;Broglie et al.,1984,Science 224:838-843)或热休克启动子,例如大豆hsp 17.5-E或hsp 17.3-B(Gurley etal.,1986,Mol.Cell.Biol.6:559-565)。可利用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电穿孔等将这些构件引入植物细胞中。为了评述这些技术,例如参见Weissbach &Weissbach,1988,Methods for Plant Molecular Biology,Academic Press,NY,Section Vlll,pp.421-463;andGyierson & Corey,1988,Plant Molecular Biology,2dEd.,Blackie,London,Ch.7-9。

核酶为能催化RNA特殊分裂的酶RNA分子。核酶作用的机理包括核1酶分子与补充靶RNA的序列特定杂交,随后细胞核内溶解分裂。特定和有效地催化Flk-RNA序列细胞核内溶解分裂的锤头状特色的核酶分子设计在本发明的范围之内。

在本发明的一个实施方案中,可将Flk-1配体、Flk-1受体本身,或含有其VEGF结合位点的片段体内施用以调节血管形成和/或维管形成。例如,施用Flk-1受体或含有该VEGF结合位点的片段可竞争性地与VEGF的结合并在体内抑制其与天然Flk-1受体的相互作用从而抑制血管形成和/或维管形成。另一方面,Flk-1的配体,包括抗Flk-1抗体或其片段可用于调节血管形成和/或维管形成。VEGF活性的拮抗剂可用于促进伤口愈合。而VEGF活性的拮抗物可用于抑制肿瘤生长。

本发明不限于例证性实施方案的范围,它们旨在说明本发明单个方面,而在功能上等同的任何克隆、DNA或氨基酸序列均在本发明的范围之内。事实上,除了本文已述之外,本发明的各种变更,根据上述陈述及附图对现有技术的普通技术人员将是显而易见的。这些变更将纳入待批的权利要求的范围之内。